Tesis Doctorales

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Conexina 46 es un regulador transcripcional en células HeLa
(Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2022) Fernández-Olivares, Ainoa; Retamal, Mauricio A.; Acuña, Rodrigo
Cancer is the second leading cause of death in the world and was responsible for around 10 million deaths in 2020. Metastatic colonies are of greatest interest to clinical oncologists as they are responsible for approximately 90% of cancer-associated deaths. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying tumor progression, local invasion, and metastasis formation represents one of the great challenges in cancer research. Connexins are membrane proteins that form ion channels that participate in cell communication, which is essential for tissues to maintain the ability to grow in a controlled manner and respond to their environment. However, this process is frequently impaired in cancer cells. This is why during the last 50 years, the role of connexins and cell communication has been highlighted in the area of cancer and much of the research effort has been directed to understanding their dysfunction in malignant neoplasms in humans. Within the Connexin family, Cx46 has been proposed as a biomarker of malignancy in breast cancer, it has also been directly correlated with the presence of cancer stem cells in glioblastoma. In addition, it has been positively correlated with invasion, self-renewal capacity and metastasis independently of GJC formation. Each of these processes of transformation towards a malignant phenotype requires the reprogramming of gene transcription. Based on the data collected in the literature, the following hypothesis is proposed, cx46 produces phenotypic changes in HeLa cells through gene regulation networks. For this, a stable cell line of HeLa cells over-expressing human Cx46 was generated. The following objectives were studied in it, 1: To evaluate phenotypic characteristics associated with the expression of Cx46 in HeLa cells by means of proliferation, self-renewal and invasion assays. 2: Determination of the subcellular localization of Cx46 by purification of nuclear proteins and confocal microscopy. 3: Determine the nuclear role of the Cx46 protein through ChIP-seq and RNA-seq studies. The results obtained show that HeLa cells transfected with human Cx46 undergo phenotypic changes such as an increase in their capacity for self-renewal proliferation, migration and invasion. In addition the nuclear presence of the protein, which is found interacting with DNA, could be evidenced. In this context, 77 differentially expressed genes could be found, of which 26 have a Cx46 peak in their promoter region. The expression network analysis determined that those genes that did not have Cx46 in their promoter region were being activated by transcription factors with which Cx46 was interacting. The data obtained in this thesis allow us to propose a new role for Cx46 as a regulator of gene transcription in the HeLa cell line. Based on the number of tumors that overexpress Cx46 with respect to their surrounding healthy tissue it is plausible to propose Cx46 as a tumor biomarker and therefore as a possible therapeutic target, in accordance with the literature.
Extrusomas de células natural killer: Vesículas artificiales derivadas de células como una alternativa innovadora de encapsulamiento de fármacos para el cáncer de pulmón
(Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2024) Carrasco Rojas, Javiera Valentina; Schuh, Christina
El cáncer de pulmón (CP) tiene la tasa de mortalidad más alta a nivel mundial. Su patogénesis es multifactorial y, aunque se recomiendan terapias dirigidas, muchos pacientes deben depender de tratamientos clásicos (por ejemplo, quimioterapia), los cuales presentan limitaciones (efectos adversos, resistencias al tratamiento, entre otros). Los extrusomas (EXT), o vesículas derivadas artificialmente de células (ACDVs), han surgido como una herramienta prometedora para superar las barreras de la traslación hacia la clínica que presentan actualmente los tratamientos acelulares basados en vesículas. Este estudio propone la generación de EXTs encapsulados con docetaxel (DTX) a partir de células Natural Killer (NK) humanas (DTX-EXTs) y evaluar su internalización en células de CP y su efecto citotóxico. También se realizaron análisis preliminares utilizando macrófagos polarizados a fenotipo M1 (EXTs-M1) para validar este método como una estrategia prometedora en la producción de ACDVs para la liberación de fármacos en el tratamiento del CP. Los EXTs se generaron por extrusión celular y se evaluaron su morfología, estabilidad y composición. Se midió su efecto citotóxico en células de cáncer de pulmón, y se investigaron los mecanismos de captación celular mediante inhibidores de diferentes vías de endocitosis. Los EXTs-NK y EXTs-M1 mostraron una morfología en forma de copa (tamaño medio <200 nm), los EXTs-NK tuvieron composición estable y su análisis Proteómico reveló proteínas presentes de manera diferencial asociadas con las características de las vesículas extracelulares (EV) y los marcadores de células NK, además de un patrón de enriquecimiento proteico distintivo. Se observó un efecto citotóxico significativo con los tratamientos EXT-DTX en comparación con los EXTs y EVs en ambas líneas celulares, con mayor eficacia en las células A549; la inducción de apoptosis corroboró estos hallazgos. Los estudios de internalización identificaron una localización perinuclear y la participación de la endocitosis mediada por clatrina como mecanismo principal en todos los grupos de vesículas. Similar fueron los hallazgos obtenidos para los EXTs-M1, en donde los DTX EXTs-M1 fueron más eficaces en la reducción de la viabilidad celular en las líneas de CP H1975 y H1299. Asimismo, se identificó preliminarmente, la endocitosis mediada por clatrina como principal mecanismo de internalización en células H1975. En conjunto, los resultados de este estudio sugieren que el uso de EXTs derivados de células inmunes, ofrece un enfoque prometedor para mejorar la entrega de quimioterapéuticos como el DTX, permitiendo reducir las dosis necesarias y, en consecuencia, minimizar los efectos adversos, lo que podría traducirse en una mejora en la calidad de vida de los pacientes con CP.
Identification of germline genetic variants in miRNA genes targeting BRCA 1/2 genes and their role in chilean familial breast cancer risk : searching for novel findings
(Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2018) Mayo Glaser, Tomas Gabriel de; Ziegler Bonicalzi, Annemarie; Jara Sosa, Lilian
Breast cancer (BC) is the most common cancer in women worldwide and the second most common malignancy as a whole, therefore constituting an important cause of death and a severe burden for public health systems. During the year 2012, it was estimated that 1.67 million new BC cases were diagnosed, which accounts for 25% of all new cancers and 15% of all cancer deaths among females. In Chile, BC is the first cause of death from cancer in women, followed by gallbladder and bile duct adenocarcinoma. Family history of BC (genetic predisposition) is one of the most important non-modifiable risk factors, being responsible for 5-15% of all cases and up to 25% of cases in women fewer than 30 years. Some familial BC cases present a dominant autosomal inheritance due to germline mutations in BRCA1/BRCA2 genes, which are responsible for up to 25% of hereditary BC cases. For the remaining 75%, other susceptibility alleles (moderate or low penetrance), could be responsible for a significant percentage of hereditary BC risk in BRCA1/BRCA2-negative families, as proposed by the current polygenic inheritance model of breast tumors. Examples of these genes are, PALB2, BARD1, ATM, CHECK2, RAD51 and XRCC3, among others. Nevertheless, 50 to 60 percent of familial BC cases carry an unknown genetic etiology. Thus, it is of vital importance to search for other novel gene candidates in order to better elucidate its genetic structure. As low penetrance susceptibility genes may account for the excess of this risk, recent research evidence strongly suggests that single nucleotide variants (SNVs) in pre-microRNA (pre-miRNAs and its boundaries) or mature microRNAs (miRNAs) genes are new possible candidates, as it is well established that they can function as oncogenes or tumor suppressor genes. In this milieu, several genetic epidemiological studies show associations between SNVs in miRNAs and BC risk, mainly through down regulation of DNA repair genes such as BRCA1/BRCA2 genes, which can be regulated by miRNAs targeting their mRNA sequences mostly at their three prime untranslated regions (3´UTRs). Considering that genetic variation is ethnic-specific, some of these studies have shown conflicting results when comparing the effect on BC risk for same variant within different populations. Currently, there are very few studies concerning variants in miRNA genes and BC risk in South American population, making the available information in this arena very scarce. Thus, the purpose of this doctoral thesis project is to identify novel genetic variants (such as SNVs, deletions or insertions) in 10 selected and experimentally validated pre-miRNA genes targeting BRCA1/BRCA2 genes. This will be carried out studying BRCA1/BRCA2-negative (also known as BRCAX) Chilean families with a strong family history for hereditary breast cancer disease. New identified variants will be searched in genetic databases and in the available literature in order to identify whether they correspond to previously described or non-previously described variants and if there are previous studies regarding these variants and familial BC disease. Also,bioinformatics analyses will be performed in order to evaluate the impact of the variant on the miRNA secondary structure and its physicochemical parameters, and comparing these results with the wild type (WT) of the same miRNA gene. Finally, using a TaqMan genotyping assay, selected variants according to specific criteria will be subjected to a case control study in order to assess if there is any association with an increased BC risk in the studied population.
Rol de la conexina 46 en la estabilización de HIF-1α y la agresividad tumoral de la línea de melanoma SK-MEL-2
(Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2021) Orellana Villena, Viviana Paulina; Retamal, Mauricio A.; Godoy Sánchez, Alejandro
El melanoma es el cáncer de piel más agresivo, cuya tasa de incidencia se encuentra en constante aumento por sobre otros tipos de tumores sólidos. Recientemente la conexina 46 (Cx46) fue descrita en este tipo de cáncer, pero se desconoce su rol en la biología de este. En otros tipos de cáncer como son el cáncer de mama y glioblastoma la Cx46 está asociada con la metástasis y el fenotipo cancer stem cells. Por otro lado, se ha sugerido que la Cx46 actúa como un factor protector frente a la muerte celular inducida por hipoxia. Interesantemente, la hipoxia activa al factor de transcripción HIF-1α el cual está relacionado con el desarrollo de tumores de mal pronóstico. La expresión de Cx46 y HIF-1α ha sido descrita de forma independiente en melanoma, y en este sentido, nuestra investigación tiene como foco evaluar la posible interrelación entre estas dos proteínas, y su posible efecto sobre la progresión tumoral en la línea celular de melanoma SK-MEL-2. Para este estudio, se estableció un modelo celular con reducción de la expresión de Cx46, en el cual se observó un aumento en la estabilización de HIF-1α mediado por la reducción de los niveles de las proteínas PHD2 y pVHL cuyo rol es degradar a HIF-1α en normoxia. Además, se observó que la reducción de Cx46 impacta negativamente sobre las características que favorecen la progresión tumoral, tales como la proliferación, migración y crecimiento de esferas tumorales. Este comportamiento menos agresivo, se explica por el estudio de proteómica el cual demuestra que la vía de señalización RAS se encuentra disminuida, específicamente por una reducción de las proteínas RAS y NFκβ y otras vías representadas por STAT3, CSPG4 e ICAM1. Todas estas relacionadas con favorecer la sobrevida celular mediante la evasión de la apoptosis, y el aumento de la proliferación y la metástasis. Finalmente, se realizó un estudio preliminar en modelo in vivo en ratones NSG, en donde se observó que la reducción de Cx46 inhibe el crecimiento tumoral al igual que en el estudio in vitro. Y junto con esto, pudimos observar a nivel de proteína, que los tumores reducidos en Cx46 presentan la diminución de los niveles de AKT, RAS y NFκβ, confirmando los datos de proteómica. Los datos obtenidos en esta tesis nos permiten proponer un mecanismo en el cual la Cx46 actúa aumentando los niveles de RAS y proteínas rio abajo (AKT y NFκβ). Lo que aumenta las características de proliferación, migración y crecimiento de esferas tumorales, asociadas al fenotipo CSCs. Lo que orientado a la aplicación clínica o traslacional nos permite pensar que la Cx46 es un target interesante de desarrollar con el fin de disminuir la agresividad tumoral del melanoma.

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