Tesis Doctorales

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    Conexina 46 es un regulador transcripcional en células HeLa
    (Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2022) Fernández-Olivares, Ainoa; Retamal Lucero, Mauricio; Acuña, Rodrigo
    Cancer is the second leading cause of death in the world and was responsible for around 10 million deaths in 2020. Metastatic colonies are of greatest interest to clinical oncologists as they are responsible for approximately 90% of cancer-associated deaths. Therefore, understanding the molecular mechanisms underlying tumor progression, local invasion, and metastasis formation represents one of the great challenges in cancer research. Connexins are membrane proteins that form ion channels that participate in cell communication, which is essential for tissues to maintain the ability to grow in a controlled manner and respond to their environment. However, this process is frequently impaired in cancer cells. This is why during the last 50 years, the role of connexins and cell communication has been highlighted in the area of cancer and much of the research effort has been directed to understanding their dysfunction in malignant neoplasms in humans. Within the Connexin family, Cx46 has been proposed as a biomarker of malignancy in breast cancer, it has also been directly correlated with the presence of cancer stem cells in glioblastoma. In addition, it has been positively correlated with invasion, self-renewal capacity and metastasis independently of GJC formation. Each of these processes of transformation towards a malignant phenotype requires the reprogramming of gene transcription. Based on the data collected in the literature, the following hypothesis is proposed, cx46 produces phenotypic changes in HeLa cells through gene regulation networks. For this, a stable cell line of HeLa cells over-expressing human Cx46 was generated. The following objectives were studied in it, 1: To evaluate phenotypic characteristics associated with the expression of Cx46 in HeLa cells by means of proliferation, self-renewal and invasion assays. 2: Determination of the subcellular localization of Cx46 by purification of nuclear proteins and confocal microscopy. 3: Determine the nuclear role of the Cx46 protein through ChIP-seq and RNA-seq studies. The results obtained show that HeLa cells transfected with human Cx46 undergo phenotypic changes such as an increase in their capacity for self-renewal proliferation, migration and invasion. In addition the nuclear presence of the protein, which is found interacting with DNA, could be evidenced. In this context, 77 differentially expressed genes could be found, of which 26 have a Cx46 peak in their promoter region. The expression network analysis determined that those genes that did not have Cx46 in their promoter region were being activated by transcription factors with which Cx46 was interacting. The data obtained in this thesis allow us to propose a new role for Cx46 as a regulator of gene transcription in the HeLa cell line. Based on the number of tumors that overexpress Cx46 with respect to their surrounding healthy tissue it is plausible to propose Cx46 as a tumor biomarker and therefore as a possible therapeutic target, in accordance with the literature.
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    Evaluación del efecto antidepresivo del secretoma derivado de células madre mesenquimáticas precondicionadas en un modelo animal de trastorno depresivo mayor
    (Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2022) Ávila Suárez, Alba Liliana; Ezquer, Fenando; Riveros, María Eugenia
    El trastorno depresivo mayor es un desorden heterogéneo y multifactorial caracterizado por episodios de al menos dos semanas de duración, en los cuales se presente al menos uno de los dos síntomas centrales. Estos son: 1.- Estado de ánimo depresivo con pérdida de interés por las actividades cotidianas y 2.- Ausencia de la capacidad de sentir placer (anhedonia). Estos síntomas traen consigo trastornos anímicos, cognitivos y fisiológicos y en los casos más severos, pueden asociarse a conductas suicidas. Si bien en la actualidad la etiología del trastorno depresivo mayor es poco conocida, se ha reportado que tanto la presencia de neuroinflamación como la reducción de la neurogénesis hipocampal adulta son eventos claves en el desarrollo de esta patología. Las terapias actuales para el trastorno depresivo mayor no están enfocadas en estas alteraciones, lo que podría explicar el alto porcentaje de refractariedad al tratamiento de pacientes con trastorno depresivo mayor frente a la terapia convencional. Por este motivo, se ha propuesto como una opción de tratamiento el uso de células madre mesenquimáticas (MSC), las cuales son capaces de producir de manera paracrina, una gran variedad de moléculas terapéuticas entre las que se encuentran moléculas anti-inflamatorias y factores neuroprotectores inductores de la neurogénesis. Estas moléculas secretadas por las MSC se pueden recuperar desde el medio de cultivo celular y en conjunto reciben el nombre de secretoma. Este trabajo se basó en la evaluación del potencial antidepresivo de la administración intranasal repetida de secretoma derivado de MSC en un modelo animal de trastorno depresivo mayor instaurado en el bioterio de la Universidad del Desarrollo. En conjunto, los datos obtenidos muestran que el tratamiento intranasal con secretoma derivado de MSC fue capaz de revertir algunas de las conductas asociadas a estados depresivos en animales, disminuyendo significativamente el puntaje global de depresión en comparación a los animales tratados con vehículo. A nivel estructural el modelo animal de depresión utilizado no mostró presencia de alteraciones del proceso de neurogenesis hipocampal adulta pero sí mostró neuroinflamación, evidenciada en un aumento de la densidad de astrocitos a nivel del hipocampo en comparación a los animales control. Este aumento no se observó en los animales tratados con secretoma intranasal, sugiriendo un efecto anti-inflamatorio del biofármaco. Adicionalmente, se observó que el secretoma derivado de MSC ejerció un efecto protector sobre los astrocitos inhibiendo el proceso de atrofia de sus prolongaciones. Los datos pre-clínicos obtenidos sugieren que la administración intranasal de secretoma derivado de células madre mesenquimáticas representa un tratamiento potencialmente eficaz para reducir los síntomas de depresión en humanos y una posible alternativa terapéutica a los tratamientos actuales para esta devastadora patología
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    Genetic modifiers associated with the variability of the aortic phenotype in patients with inheritable connective tissue disorders(ICTDs)
    (Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2022-05-27) Jiménez Bejarano, Yanireth José; Calderón Giadrosic, Juan Francisco
    Inheritable Connective Tissue Disorders (ICTDs) are rare genetic diseases that involve variants in genes that encode for proteins of the extracellular matrix (ECM). ICTDs affect patients from birth and their symptoms are present in the cardiovascular system, musculoskeletal system, the skin, the eye and the respiratory system. This family of diseases includes Marfan Syndrome (MFS), Loeys-Dietz Syndrome types I, II, III and IV (LDS), Ehlers- Danlos Syndrome type IV (vEDS), among others, and are caused by variants in genes that code for different effectors or regulators of the Transforming Growth Factor beta (TGFβ) signaling pathway, including genes that encode for ECM components that play active roles in the signaling activity of this pathway. The cardinal feature of these diseases is the enlargement and rupture of big vessels and, most prominently, the aorta. Aneurysm and dissection of the aorta is the main cause of mortality in these patients but the clinical course of MFS and other ICTDs differs considerably in terms of age of onset and severity, even among individuals who share the same causative variant. ⁠This led us to hypothesize the existence of genetic variants elsewhere in the genome that influence the severity of the cardiovascular phenotype in MFS. We recruited familial and sporadic MFS patients that were subsequently classified as having severe (n=8) or mild aortic phenotype (n=14) according to the age of presentation of the first cardiovascular manifestation and/or catastrophe related to the aorta. We used Exome Sequencing (ES) to identify genetic variants that may be associated with the severity of this clinical manifestation, and we performed linkage analysis using the software VAAST. We identified 5 genes associated with severe aortic phenotype and 3 genes that could be protective of this phenotype in MFS. These genes regulate components of the ECM, TGFβ pathway and other signaling pathways that are involved in the maintenance of the ECM and/or angiogenesis. Further studies will be required to understand the functional effect of these variants and explore novel, personalized risk management strategies and, potentially, new therapies for these patients.
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    Characterizing the molecular mechanisms of immune dysregulation in proteasome-related interferonopathies and other autoinflammatory diseases
    (Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2022-01) Jarur Chamy, Valentina Lucía; Poli, Cecilia; Carrión Arriagada, Flavio
    Monogenic Immune Dysregulatory Syndromes are rare life-threatening diseases in which a single genetic defect causes global immune dysregulation manifested by either immunodeficiency, autoinflammation or autoimmunity in a nonexclusive way. Particularly, Proteasome-associated autoinflammatory Syndromes (PRAAS) are a group of Immune Dysregulatory Syndromes in which loss of function variants in proteasome subunits cause Type I IFN-mediated autoinflammation, ulcerative skin lesions and lipodystrophy through still unknown mechanisms. Proteasome-related Autoinflammation and Immunodeficiency Disease (PRAID) is a novel PRAAS caused by pathogenic variants in POMP, a proteasome assembly chaperone. PRAID patients present PRAAS-like clinical manifestations but also, they have an increased susceptibility to pneumocystis and mycobacterial infections, delineating a combined immunodeficiency that paradoxically co-exist with the autoinflammatory features in this Immune Dysregulatory Syndrome. PRAID patients present low expression of proinflammatory cytokines in T cells in vitro and NFkB deficiency is a known cause of immunodeficiency. In this regard, the proteasome plays a critical role in the activation of NFkB pathway that could be underlying the immunodeficiency in PRAID patients. Conversely, here we identified a sustained up-regulation of NFkB signaling in PRAID patients, suggesting the contribution of NFkB to the Type I IFN-mediated autoinflammatory phenotype in PRAID patients. Additionally, we identified that Type I IFN and NFkB dysregulation in PRAID patients are mediated by the Protein Kinase R (PKR), a cytosolic RNA sensor that triggers Type I IFN and NF-kB signaling upon activation. The mechanisms by which PKR is up-regulated in PRAID still remains elusive and a constitutive activation of PKR does not explain the immunodeficiency in these patients. In this regard, we demonstrated that pathogenic variants in POMP causing PRAID impair the interaction of the chaperone POMP with the immune-proteasome catalytic subunits suggesting a potential role of impaired immune proteasome assembly in the combined immunodeficiency of PRAID patients. PRAID supports the notion of Immune Dysregulatory Syndromes as complex immune-related phenotypes with more than one compromised pathway, reinforcing the relevance of a complete characterization of the pro-inflammatory environment in each genetically-determined disease. In this regard, we used the Type I IFN Signature previously standardized in PRAID patient-derived cells as a translational application for the diagnosis of Immune Dysregulatory patients with clinical features compatible with Type I IFN dysregulation. Here, we empirically demonstrated the relevance of Type I IFN evaluation through the Type I IFN signature for the genetic interpretation and functional validation of novel genetic candidates in patients with type I IFN dysregulation with and without proteasome dysfunction.
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    Rol de la conexina 46 en la estabilización de HIF-1α y la agresividad tumoral de la línea de melanoma SK-MEL-2
    (Universidad del Desarrollo. Facultad de Medicina, 2021) Orellana Villena, Viviana Paulina; Retamal Lucero, Mauricio; Godoy Sánchez, Alejandro
    El melanoma es el cáncer de piel más agresivo, cuya tasa de incidencia se encuentra en constante aumento por sobre otros tipos de tumores sólidos. Recientemente la conexina 46 (Cx46) fue descrita en este tipo de cáncer, pero se desconoce su rol en la biología de este. En otros tipos de cáncer como son el cáncer de mama y glioblastoma la Cx46 está asociada con la metástasis y el fenotipo cancer stem cells. Por otro lado, se ha sugerido que la Cx46 actúa como un factor protector frente a la muerte celular inducida por hipoxia. Interesantemente, la hipoxia activa al factor de transcripción HIF-1α el cual está relacionado con el desarrollo de tumores de mal pronóstico. La expresión de Cx46 y HIF-1α ha sido descrita de forma independiente en melanoma, y en este sentido, nuestra investigación tiene como foco evaluar la posible interrelación entre estas dos proteínas, y su posible efecto sobre la progresión tumoral en la línea celular de melanoma SK-MEL-2. Para este estudio, se estableció un modelo celular con reducción de la expresión de Cx46, en el cual se observó un aumento en la estabilización de HIF-1α mediado por la reducción de los niveles de las proteínas PHD2 y pVHL cuyo rol es degradar a HIF-1α en normoxia. Además, se observó que la reducción de Cx46 impacta negativamente sobre las características que favorecen la progresión tumoral, tales como la proliferación, migración y crecimiento de esferas tumorales. Este comportamiento menos agresivo, se explica por el estudio de proteómica el cual demuestra que la vía de señalización RAS se encuentra disminuida, específicamente por una reducción de las proteínas RAS y NFκβ y otras vías representadas por STAT3, CSPG4 e ICAM1. Todas estas relacionadas con favorecer la sobrevida celular mediante la evasión de la apoptosis, y el aumento de la proliferación y la metástasis. Finalmente, se realizó un estudio preliminar en modelo in vivo en ratones NSG, en donde se observó que la reducción de Cx46 inhibe el crecimiento tumoral al igual que en el estudio in vitro. Y junto con esto, pudimos observar a nivel de proteína, que los tumores reducidos en Cx46 presentan la diminución de los niveles de AKT, RAS y NFκβ, confirmando los datos de proteómica. Los datos obtenidos en esta tesis nos permiten proponer un mecanismo en el cual la Cx46 actúa aumentando los niveles de RAS y proteínas rio abajo (AKT y NFκβ). Lo que aumenta las características de proliferación, migración y crecimiento de esferas tumorales, asociadas al fenotipo CSCs. Lo que orientado a la aplicación clínica o traslacional nos permite pensar que la Cx46 es un target interesante de desarrollar con el fin de disminuir la agresividad tumoral del melanoma.